500年来，人们一直对《蒙娜丽莎》神秘的微笑莫衷一是。不同的观者或在不同的时间去看，感受似乎都不同。有时觉得她笑得舒畅温柔，有时又显得严肃，有时像是略含哀伤，有时甚至显出讥嘲和揶揄。在一幅画中，光线的变化不能像在雕塑中产生那样大的差别。但在蒙娜丽莎的脸上，微暗的阴影时隐时现，为她的双眼与唇部披上了一层面纱。
而人的笑容主要表现在眼角和嘴角上，达 ·芬奇却偏把这些部位画得若隐若现，没有明确的界线，因此才会有这令人捉摸不定的“神秘的微笑”，此微笑的含义是“世界十大未解之谜”之一。
哈佛大学神经科专家利文斯通博士说，蒙娜丽莎的微笑时隐时现，是与人体视觉系统有关，而不是因为画中人表情神秘莫测。
戴维·利文斯通博士是视觉神经活动方面的权威，主要研究眼睛与大脑对不同对比和光暗的反应。利文斯通说：“笑容忽隐忽现，是由于观看者改变了眼睛位置。”她表示，人类的眼睛内有两个不同部分接收影像。中央部分(即视网膜上的浅窝)负责分辨颜色、细致印记。环绕浅窝的外围部分则留意黑白、动作和阴影。
据利文斯通说，当人们看着一张脸时，眼睛多数集中注视对方的双眼。假如人们的中央视觉放在蒙娜丽莎的双眼，较不准确的外围视觉便会落在她的嘴巴上。由于外围视觉并不注重细微之处，无形中突出了颧骨部位的阴影。如此一来，笑容的弧度便显得更加大了。不过，当眼睛直视蒙娜丽莎的嘴巴，中央视觉便不会看到阴影。
利文斯通说：“如果看着她的嘴巴，使得我们永远无法捕捉她的笑容。”蒙娜丽莎的笑容若隐若现，源于人们的目光不断转移。利文斯通指出，若要临摹《蒙娜丽莎》，描绘口部时便要望着别处。
后经使用x光照射，发现蒙娜丽莎嘴部涂画40层颜料，每一层都很薄。证实并不是用笔所画，而是作者把颜料涂在手上继而画在上面。
而每一层颜料都要几个月才能风干，推算大约10年才画好蒙娜丽莎的微笑。
1993年，加拿大美术史家苏珊·吉鲁公布了一项令人震惊的研究成果。她说蒙娜丽莎那倾倒无数观赏者的口唇，是一个男子裸露的脊背。这一论断既新鲜又荒诞，然而论证是有力的。集画家、雕刻家、建筑师、工程师及科学家等多种才艺于一身的达·芬奇，可谓是个“怪杰”。
他喜欢穿粉红色外套，在胡须上毫无顾忌地涂上五颜六色，还常称自己解剖过不下30具死尸。他还是个左撇子，习惯从右到左倒着书写，别人要借助镜子才能读出他写的东西。因此借助镜子亦不失为欣赏者读画的一种方法。旋转90度后从镜中看蒙娜丽莎抿着的笑唇，恰好是一个背部线条分明的结实男性脊背以及左臂和肘部的一角；再说，表现人体美和呼唤人性的觉醒，既是大师的人生哲学，又是他的艺术观。
确实，在不同角度不同光线下欣赏这幅画，人们都会得到不同的感受。那微笑时而温文尔雅，时而安详严肃，时而略带哀伤，时而又有几分讽嘲与揶揄，神秘莫测的微笑显露出人物神秘莫测的心灵活动。
几百年来，“微笑”的新解层出不穷。诸如微笑不露皓齿是因原型虽典雅美丽却口齿不齐；原型因爱女夭折，忧郁寡欢，难掩凄楚之态；更有甚者，把蒙娜丽莎从贵妇宝座上推落下来，把原型贬为妓女，故而微笑中带着讥嘲和揶揄。
美国马里兰州的约瑟夫·鲍考夫斯基博士认为：“蒙娜丽莎压根就没笑。"
法国里昂的脑外科专家让·雅克·孔代特博士认为蒙娜丽莎刚得过一场中风，请看，她半个脸的肌肉是松弛的，脸歪着所以才显得微笑。
达芬奇名画《蒙娜丽莎》的神秘微笑一直是世人难以解开的谜团，人们很早就对蒙娜丽莎到底是不是在微笑有争论。
法国巴黎卢浮宫搜索公布蒙娜丽莎的微笑包含了83%的高兴、9%的厌恶、6%的恐惧和2%的愤怒。这一结果是由荷兰阿姆斯特丹的一所大学应用“情感识别软件”分析出来的。
达芬奇传世画作《蒙娜丽莎》的微笑如何产生似有若无效果。 科学家透过高能X光，详细分析蒙娜丽莎脸上不同层次的颜料排列及成份。科学家发现，画作共享了40层极纤薄的油彩，每层厚度仅2微米(头发厚度的1/50)。油彩由些微不同的颜料组成，营造出蒙娜丽莎嘴角模糊和阴影效果，令人隐约感到她在微笑，但仔细看时笑容就消失无踪。
由于画作上没画笔的痕迹，科学家估计达芬奇是把油彩涂于手指上绘画。达芬奇使出招牌绝技“晕涂法”(Sfumato)，整幅画融合了共40层超薄油彩，而且达芬奇可能先把油彩涂在手指，再抹在画上。 带领研究小组的沃尔特表示，纤薄油彩是画作引人入胜的关键。
能使用如此纤薄的油彩，证明达芬奇功力极深厚。同时，由于每层颜料都要数月才能风干，估计这种特殊效果可能花了数年时间才能完成。
不同的观者或在不同的时间去看，感受似乎都不同。有时觉得她笑得舒畅温柔，有时又显得严肃，有时像是略含哀伤，有时甚至显出讥嘲和揶揄。
在一幅画中，光线的变化不能像在雕塑中产生那样大的差别。但在蒙娜丽莎的脸上，微暗的阴影时隐时现，为她的双眼与唇部披上了一层面纱。而人的笑容主要表现在眼角和嘴角上，达·芬奇却偏把这些部位画得若隐若现，没有明确的界线，因此才会有这令人捉摸不定的“神秘的微笑”。
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